直到本周二，在一场线上分享会中，SHERLOCK 系统的主要开发者、CRISPR 应用领域的先驱之一张锋再次露面，用近 40 分钟的时间分享了这一新冠检测神器背后的开发历程和技术解决路径。
SHERLOCK 系统基于基因编辑工具 CRISPR-Cas13，最初曾在多种人类样本（如唾液）中发现寨卡、登革热等病毒的 RNA 序列，甚至一些与癌症突变相关的序列，其对 RNA 和 DNA 的检测灵敏度都达到了单分子级。
这种检测方法与验孕棒类似，只需一张试纸就能显示出病毒感染检测结果，在新冠病毒的检测中，该技术只需 1 小时就能判断是否存在新冠病毒。
“我们的产品通过两步改造最终解决了两个关键问题”，张峰在分享过程中说。

生辉全程记录了张锋的分享过程，以下为基于原意修改的分享实录：
我之前一直在麻省理工学院的实验室开发用于分子诊断的 CRISPR 辅助系统。几年前，我们开发了 SHERLOCK，用于检测 SARS 病毒和寨卡病毒等。今年年初，我在《纽约时报》读到了对一种新型病毒的报道，也就是现在的新型冠状病毒，当时在病毒出现的地方爆发了众多连锁反应。我想，也许可以利用 SHERLOCK 去检测这种新型病毒。于是，我们的实验室开始重新设计不同引物和 Guide-RNA (引导 RNA），希望能够查明新冠病毒的部分序列。
但在几个星期后，COVID-19 的病毒序列正式对外公布。1 月下旬，我开始收到很多来自中国同事的邮件，其中一位在武汉的同事在 2 月初给我发来这张他站在武汉火车站附近的照片，他说过去这里人声鼎沸，但因为新冠病毒的传播我们不得不封锁整个城市，你能不能与我们合作开发一种方法，在病毒传播的初期实现快速诊断。

于是我们启动了这一项目。
SHERLOCK 的工作原理如下，它需要两步反应，首先是扩增，但 SHERLOCK 的扩增过程非常简单，不需要 PCR 的过程，而是采用等温扩增的方法。这就意味着病毒经过等温扩增后，在 CRISPR 蛋白中加入一个 Guide-RNA 就可以准确识别病毒序列。在识别病毒序列的过程中，Cas 蛋白就不仅可以切割病毒序列，还可以切割探针进而读出结果。
我们用的探针是一段两端携带分子的较短的等位基因，这让其可以在试纸上显示结果。如果病毒存在就会看到两条线，如果病毒不存在就只能看到一条线，这和验孕试纸的运作方式十分类似。随后，我们用开发的引物和 Guide-RNA 制作了简易的检测试剂盒，供全球的科学家和医院使用，并开始收集试验结果。

我们收到的第一组数据是来自于华盛顿大学的 Keith Jerome 和 Greninger 小组。

在 3 月，西雅图是新冠病毒传播最肆虐的区域之一，所以华盛顿大学的研究小组访问了不同的病人样本并用 SHERLOCK 系统展开检测测试。他们发现通过鼻咽拭子提取唾液样本后，SHERLOCK 能够准确检测出病毒。检测试纸（下图）显示，上方出现的横线代表病毒存在，下方的横线是阳性对照，我们能够看到在所有的阳性样品上方都出现了检测线。

除了和 Keith 的小组合作，另一个合作者也和上述团队一同对 SHERLOCK 进行测试。他们从取样测试中发现灵敏度相当不错，能够达到 93％，同时具有 100％的特异性，不会显示假阳性信号。基于这些数据，他们开始申请许可并在泰国当地的医院大范围使用 SHERLOCK，我们也得到了有效的反馈（如下图）。

根据不同的合作者的反馈，我们了解到 SHERLOCK 可以有效地检测新冠病毒，但它仍有一个不容忽视的缺点。SHERLOCK 检测是两步反应，其中包含运行扩增、打开扩增管再将试剂移到第二个反应管中，之中隐藏着试剂污染的风险，这甚至会诱导产生假阳性。
所以我们尝试解决这一问题，并开发了一个新的反应体系，我们称之为 STOPCovid 1，这是 SHERLOCK 检测的一个部分。我们将扩增过程和 CRISPR 检测过程整合至单一反应中。它的工作原理是这样的：通过鼻咽拭子收集唾液样本，然后提取其中的 RNA，让其进入拷贝反应并在 60°C 的环境中培养一个小时，最后将检试纸直接放入反应管读取病毒检测结果。

但实现上述过程之前必须要解决一些问题。
第一，简化病毒 RNA 的提取。早在 3 月或 4 月，RNA 提取试剂盒和提取柱非常短缺，因此我们开发了提取缓冲液，称为快速提取（QuickExtract），通常用于分析病毒的 RNA 基因组。事实证明，QuickExtract 能够快速分解鼻咽拭子的唾液并释放病毒 RNA，无需基于提取柱纯化等过程，同时我们发现，QuickExtract 和通过提取柱检测的灵敏度水平表现相似（下图）。

第二个问题，反应温度。STOPCovid 1 的反应温度是 60°C，而我们之前选用的 CRISPR 蛋白大部分都不稳定，它们的工作温度是在 37°C。在 60°C 的条件下，蛋白会失去活性。所以我们从嗜热细菌中寻找合适的蛋白，并发现了两种合适的样品：来自 Aac 细菌和 Aap 细菌的蛋白都能够在 60° 下稳定存活，这样我们就可以实现扩增和检测的过程。从图中可以看见 Aap 细菌的蛋白（蓝线）的效果更好，稳定性也更强，我们用其检测 200 份左右的样品得到了下面的数据图。

但我们仍希望让检测更加快速地进行，也能识别更多信号。为了达到这一目标，我们测试了不同的反应添加物，以增强反应过程。因此，我们订购了多种不同的化合物以提高反应效率。通过系统的分析，发现甘氨酸（Glycine）和牛磺酸（Taurine）是效果最好的添加剂，可以同时增加反应速度、信号强度和反应容量。大家可能都听说过牛磺酸，可以增强人体机能，让我们能熬夜看论文（笑）。


以上是我们所做部分工作，我们将上述每一步改造过程结合起来开发了 STOPCovid 1 系统。我们也将他与 LAMP 检测方式（环介导等温扩增）进行了比较。从左图中可以看到，随着时间的推移，LAMP 会出现误报信号。图中右侧的三条线显示，它们的实际信号输出低于检测阈值。而右图中数据显示，如果添加了 CRISPR 蛋白和上述添加剂，可以摆脱假阳性信号，实现 100% 的检测特异性。而这一反应甚至可以在简易水浴环境下进行，低成本投入却能获得准确的检测结果。

但与 SHERLOCK 系统相比，STOPCovid 1 系统虽然简单便易，但检测灵敏度仍未达到同等水平，因此，我们又开发了 STOPCovid 2 系统，利用磁性转珠（BEAD）优化 RNA 提取和富集过程以提高特异性和敏感度。
STOPCovid 2 的主要工作方式是将鼻咽拭子样本添加到反应管中，利用磁力控制实现病毒 RNA 的裂解，再利用 BEAD “捕捉” RNA 将其提取出。此时 RNA 的裂解缓冲液仍保留在 BEAD 上，但已经浓缩成较小的体积。加入 STOP Covid 反应试剂，充分溶解后可以用荧光或者试纸的方式进行检测。

这是（下图）STOPCovid 1 和 2 之间的对比，根据两个不同的患者样本。不难发现 STOPCovid 1 的检测灵敏度与 RT-qPCR CT 值 30 相当。而 STOP Covid2 可以达到的 RT-qPCR CT 值为 40。所以基于 Covid-19 患者的输入统计情况可以发现，如果 CT 值达到 40，则证明它可以成功检测几乎 100％的病人， 如果 CT 值为 30，则证明只能成功捕获 60％的患者。所以将 CT 值提高至 40-50 左右非常重要。值得注意的是， CT 值达到 40 的患者感染力可能有所减弱，因为病毒向环境扩散的能力显著降低。

随后，我们的合作者展开了系统的测试，他们共检测的 400 余个样本，其中包含 202 个阳性样本和 200 个阴性样本。结果显示，STOPCovid 2 能够得到 93.1% 的灵敏度和 98.5% 的特异性，检测结果与 RT-qPCR 检测的灵敏度和特异性几乎一致。

这是其中 200 个样本检测结果，可以看到在远端才出现了个别假阳性情况。

随后，我们又将患者打散再次进行测试。左侧显示在阴性测试中，患者均无法检测出病毒，右侧的阳性患者中，能够检测出积极的信号。检测的 CT 范围在 20-35.7 之间。


目前，我们已经在开发设计一种小型的检测仪器，不需要移液器等设备就能实现检测。我们设计的工作方式是，仪器中将包含一个富集管，操作人可以将蘸有唾液的棉签直接插入溶解病毒的富集管内，提取后将病毒溶解在提取缓冲液中，最后插入设备运行 30 分钟就能完成测试。我希望这能帮助人们以一种非常简单的方式检测新冠，尤其是护理机构和家庭中能够实现快速检测。
我的分享就到这里，我们将继续努力。我想感谢我的实验室成员和合作者，以及那些支持这项工作的资助机构，谢谢。
在随后提问环节中，张峰也回答了一些观众提问，内容整理如下：
提问：能检测到多大的病毒 RNA 片段？
张锋：STOP Covid 中的 Guide-RNA 是一段 24 个碱基配对的序列，我们用它来识别部分病毒，但只是其中一个引物，我们其实用了六个不同的引物以扩大检测片段，其中包含 2 轮检测，这就是为什么 STOP Covid 能够得到更好的灵敏度。
提问：检测价格估计会是多少钱？
张锋：检测费用取决于测试的规模。酶、Guide-RNA、引物等都需要生产，每次检测的价格或许在一美元左右，或者稍多于一美元，如果能够实现规模化的制造，检测的价格可能会更便宜，
提问：甘氨酸和牛磺酸的工作原理是什么？ 
张锋：我们目前也不太清楚甘氨酸和牛磺酸的工作原理，它们可能起到维持蛋白质稳定性的作用，以确保他们在反应中更稳定。我们测试的添加剂是可商购的，一共有 96 种，包含冻干试剂、优化特定反应的生化试剂，甚至是结晶体。
提问：有一个瑞士的研究小组将纳米金颗粒生物传感器用于环境内新冠病毒含量的监测中，在实现这一目的之前需要完成哪些必要的步骤？
张锋：所有这些环境监测项目都可以使用分子检测方法来完成，无论是 PCR、等温扩增甚至是基于等温扩增的 CRISPR 检测。最初的步骤是收集环境中的样品并将其浓缩，目前已经有很多设备可以实现这一过程，例如 RNA 提取柱可以将较大的输入量浓缩到较小的体积中，如果这些方法能够增加测试的灵敏度，我们都可以去尝试。
当然，研究人员已经使用这种方法来测试废水，麻省理工学院的一位教授一直在使用 PCR 检测法来寻找废水样本中新冠病毒。这一研究也在马萨诸塞州污水处理局网站线上发布，你可以去看看。而随着 Covid-19 在美国的传播可以看到污水内病毒含量的增加和降低，这一数据可以用于监测阳性病例患者的数量变化，这些都是非常有用的应用。
提问：新冠肺炎不是我们最后一次遇到的传染病，这种检测方式对我们日常遇到的其他病毒是否有效？
张锋：检测中的反应是一个通用的分子扩增反应过程，所以假设病毒的 DNA 或 RNA 可以从病毒颗粒中释放出来，那么就应该可以读取它。但有一个挑战是，你从病人身上收集的病毒或样本可能含有抑制剂，会阻止扩增或阻止脆性病毒的检测。因此，有不同的方法去降解抑制物。第一种，添加裂解蛋白的蛋白酶后在进行复制检测。第二种，检测过程中可能存在小分子化合物，因此你可能需要用到过滤器等设备，降低抑制剂的含量。
提问：检测出的阳性信号对确定病毒含量来说是否有价值？它是否处于线性动态范围内？
张锋：有这个可能性。我们已经发现将 LAMP 和 CRISPR 反应结合会得到一种类似二进制的信号 —— 阴性或阳性。但当病毒载量变大，高病毒负载的信号出现的时间会比较慢，低病毒负载的信号出现时间会比较长。我认为有可能生成一条以不同输入浓度为变量的标准曲线。我们在弄清楚检测信号的上升时间，也许可以用它来推断病毒载量。
目前我们还没有足够的病人样本数据，还无法证实这一情况，其中最重要的变量是在患者样本中可能含有的抑制剂数量，所以我认为对于纯化的 RNA 样本可以建立一个标准曲线，但对于病人样本，我们还需要做更多工作。
提问：可以一次性检测多种病毒吗？
张锋：这是有可能的。可以使用多个 CRISPR 蛋白，多路裂解 RNA 或 DNA。例如可以一个用于流感，一个用于 Covid-19，一个用于呼吸道融合病毒 RSV 等，每一种病毒会发出不同的颜色作为信号，利用这一点来实现多路复用，检测多种病毒。
提问：与 CRISPR Cas12a 检测相比，主要功能差异是什么？
张锋：在反应中我们使用 Cas12b 作为 CRISPR 蛋白，原因是部分 Cas12b 来自嗜热细菌，这让其能够在 60℃下工作。Cas12a 在 37℃下可以工作，但是在 60℃下就不行了。这也是之所以我们用 Cas12b 的原因。

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